Delapan belas strain mikroorganisme termo-halofilik telah berhasil diisolasi dari kawasan sumber air panas bawah laut Pria Laot Sabang. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh, mengidentifikasi dan menentukan kondisi optimum dari isolat lokal Pria Laot Sabang yang potensial memproduksi protease termostabil. Empat isolat (PLS A, PLS 75, PLS 76 dan PLS 80) dilakukan uji kualitatif terhadap aktivitas protease menggunakan media kasein dan susu skim. Bakteri penghasil protease diidentifikasi morfologinya menggunakan pewarnaan Gram dan Scanning Electron Microscop (SEM). Penentuan urutan nukleotida dilakukan dengan cara mengamplifikasi fragmen gen 16S rRNA dengan primer com-1F dan com-1R menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Produksi protease dianalisis dengan kurva pertumbuhan dan aktivitas protease dengan variasi waktu inkubasi dan suhu. Kurva pertumbuhan diukur dengan menentukan berat sel kering dan aktivitas enzim diuji menggunakan metode Anson dengan kasein sebagai substrat. Dari keempat isolat yang diuji, hanya PLS A yang potensial menghasilkan protease yang ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening pada media kasein dan susu skim. Kondisi optimum produksi protease dari PLS A menunjukan aktivitas protease tertinggi pada waktu 18 jam dan suhu 650C dengan aktivitas sebesar 0,035 (Unit/mL). Hasil identifikasi morfologi memperlihatkan bahwa PLS A tergolong bakteri Gram negatif berbentuk batang dengan profil morfologi yang seragam. Hasil penjajaran urutan fragmen gen 16S rRNA menunjukan bahwa PLS A merupakan strain baru.Kata kunci : Protease Termostabil, Isolat lokal Pria Laot Sabang, Halofilik, Bakteri termofilik