Gljiva Ophiostoma novo-ulmi uzročnik je druge pandemije holandske bolesti brijesta, traheomikoze koja dovodi do sušenje i propadanje brijesta diljem Europe, Sjeverne Amerike i centralne Azije. Vrsta O. novo-ulmi dijeli se na dvije podvrste, O. novo-ulmi ssp. novo-ulmi i O. novo-ulmi ssp. americana, koje se mogu hibridizirati. U ovom radu su primjenom PCR-RFLP analize gena cu i col1 karakterizirani izolati gljive O. novo-ulmi koji zaražavaju nizinski brijest na području Hrvatske (lokaliteti Nova Kapela, Đurđevac i Jastrebarsko). Dokazano je da su u Hrvatskoj prisutne obje podvrste, iako je podvrsta O. novo-ulmi subsp. novo-ulmi znatno učestalija u odnosu na podvrstu O. novo-ulmi subsp. americana na istraženim lokalitetima. Nadalje, na svim lokalitetima je dokazana prisutnost hibridnih izolata. Ovo istraživanje po prvi puta pruža detaljniji uvid u strukturu uzročnika holandske bolesti brijesta u Hrvatskoj. ; Fungus Ophiostoma novo-ulmi is a causal agent of the second pandemic of Dutch elm disease, vascular wilt disease responsible for the death of elm trees across Europe, North America and central Asia. Species O. novo-ulmi is separated into two distinct subspecies, O. novo-ulmi subsp. novo-ulmi and O. novoulmi subsp. americana, which can hybridize. In this work, PCR-RFLP analysis of cu and col1 genes was used for characterisation of O. novo-ulmi isolates which infect Ulmus minor in Croatia (sites Nova Kapela, Đurđevac and Jastrebarsko). It was proven that in Croatia both subspecies are present, although O. novo-ulmi subsp. novo-ulmi is far more frequent in comparison with O. novo-ulmi subsp. americana at investigated sites. Moreover, presence of hybrid isolates is proven at all sites. This research provides first detail insight into the structure of causal agent of Dutch elm disease in Croatia.